전염이 어려운 세포의 유전자 배달을 위해 싱가포르 국립대 학자들은 미국 제너레이터사의 지질체 압출기를 이용한 내노스칼레 저널에 성과를 게재한 미세세포 낭포 기술(mCVT)을 이용해 내포된 유전자 배달 시스템을 만들었다.원문의 전체 이름은 다음과 같다.Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI

싱가포르 국립대 연구진은 이 연구에서 미세세포 낭포 기술(micro Cell Vesicle Technology mCVT) 기반의 새로운 중첩형 유전자 배달 플랫폼 시스템을 소개했다.이 유전자 배달 플랫폼 시스템은 세포막과 양이온 지질이 융합돼 난전염(hard-to-transfect HTT) 세포의 전염 효율을 높이는 데 쓰인다.미세세포 낭포의 세포막 성분은 복합체 포탄 전체에 특이성을 부여해 전염 과정에서 복합체 세포의 독성을 감소시키고, 양이온 지질은 유전물질과 결합하는 동시에 mCVTs에 구조적 완전성을 제공한다.

배경

유전자 전달은 외래 DNA를 진핵세포로 끌어들이는 과정이다.예를 들어 기초 연구 (예를 들어 약물 발견과 기능 단백질의 기리 연구) 와 임상 응용 (예를 들어 유전자 치료) 에서 치료성 또는 기능성 유전자를 전달하여 세포 과정을 변화시킨다.효과적인 유전자 전염은 외래 핵산을 세포에 성공적으로 도입해야 할 뿐만 아니라 그 후 세포에서 운반하고 표현해야 한다.DNA 분자 자체가 음전하를 띠기 때문에 일반적인 형태에서는 세포 내화가 어렵기 때문에 도전적인 임무다.그래서 사람들은 효과적인 유전자 전달 시스템 개발에 큰 관심을 갖게 되었다.지난 수십 년 동안 사람들은 바이러스 기반 배달 시스템에서 비바이러스 운반체에 이르기까지 많은 양의 운반체 시스템을 탐색했습니다.비바이러스 유전자 배달 운반체의 전염 효율은 상대적으로 낮지만 안전성과 임상 수용도 면에서 양이온 지질 시스템과 중합체 기반 플랫폼이 주요 예가 될 것으로 보인다.표1은 현재 자주 사용하는 전염 시약이나 방법의 주요 장단점을 정리했다.

이상적인 비바이러스 유전자 배달 시스템은 대상 유전자의 최대 발현을 보장하기 위해 필요한 DNA 분자를 특정 세포 유형으로 효과적으로 배달 할 수 있어야합니다.그러나 현재 시판되고 있는 전염 시약은 특히 전염이 어려운 (HTT) 세포를 전염시키는 데 사용될 때 이러한 기준에 크게 미치지 못하는 것으로 알려져 있습니다.

HTT 세포는 일반적으로 3세대 세포, 배아 줄기 세포 및 3T3-L1 (생쥐 전 지방 세포), U937 (인간 단핵 세포), Jurkat (인간 T 림프 세포), HUVEC (인간 배꼽 정맥 내피 세포) 등과 같은 일부 영생화 세포 계열을 포함합니다.통계에 따르면 시판 시약을 사용하여 HTT 세포에 입자 전염을 하는 효율은 항상 25% 를 넘지 않는다.HTT 세포가 외래 물질과 입자에 대한 흡수율이 낮은 이유 중 하나는 대사 활성도가 낮기 때문이다.또한 이 세포들은 일반적으로 사용되는 전염 시약으로 인한 세포 교란에 매우 민감하며 세포 독성을 초래하여 결국 세포를 죽일 가능성이 있습니다.

최근에는 세포 유래 배달 시스템이 활성 화물 분자를 일정 부분 특이적으로 목표 부위로 전달할 가능성이 있다는 점에서 상당한 관심을 얻고 있다.실제로 많은 연구들은 단핵세포에서 파생된 약물 배달 시스템 (DDS) 을 사용하여 화학 요법 약물과 입자 DNA (pDNA) 를 종양으로 정방향 배달하거나, 적혈구에서 파생된 DDS를 사용하여 혈액 순환을 연장하고 pDNA를 혈액 세포로 정방향 배달하는 것을 탐색했다.모체 세포를 보존하는 세포막 성분은 이러한 세포 기반 약물 배달 시스템에 특정 대상 세포를 식별하는 능력을 부여해 신체 면역 체계의 식별 능력을 회피함으로써 촉진될 수 있는 것으로 추정된다.

중대한 치료 의의에도 불구하고 지금까지 세포 기반 DDS는 유전자 전달에 대한 모든 잠재력이 크게 개발되지 않았다.해결해야 할 핵심 과제는 외비체 형태와 같은 세포 유래 DDS의 번거로움과 낮은 통량 분리/생산 과정, 차등 유전자 적재/복합 기술입니다.따라서 이들 시스템은 내적 표적성 면에서 우세한 것 같지만 생산량과 pDNA 적재 효율 면에서 한계가 크다.그러므로 이러한 제한을 극복하기 위하여 우리는 여기에서 새로운 중첩유전자배달시스템을 개발할것을 제기하였는데 이 시스템은 세포막성분과 양이온지질성분으로 구성되였는데 전자는 표적세포의 내화를 강화하고 후자는 pDNA의 적재를 강화하는데 사용되였다.

이 연구에서 우리는 양이온 지질과 세포막의 융합을 통해 얻은 새로운 혼합 배달 플랫폼인 미세 세포 낭포 기술 (mCVTs) 의 발전을 묘사했다.mCVTs를 생산하기 위해서는 먼저 Goh 등이 설명한 것처럼 저투수 용액으로 세포를 처리하여 고잉 세포 (CG는 세포기 세포에 세포질이 없음) 를 얻습니다.저투과용액은 질막에 짧은 개구부를 형성하여 세포내의 내용물을 제거하는 동시에 질막의 완전성을 유지할수 있다.서로 다른 세포가 물 매체에 떠 있는 CG는 건조한 DOTAP 지질 박막을 수화하는 데 사용되며, 그 후 지질체 압출기를 통해 압출되어 압출된 DOTAP 지질체와 비슷한 평균 유체 역학적 크기와 Zeta 전위의 mCVTs를 제공한다.이 연구에서 우리는 mCVTs가 입자와 복합되어 목표 세포에 내화될 수 있으며 세포의 독성이 가장 적다는 것을 증명했다.흥미롭게도 서로 다른 세포 유형에서 생성 된 mCVTs를 몸 밖에서 비교했을 때 mCVTs가 출처 한 세포 유형에 대해 훨씬 더 높은 전염 효율을 보였다.

방법 및 결과

그림자 세포 (CG 무세포질 및 세포기 세포막) 를 제조하여 mCVTs의 반복 가능성과 안전 상태를 보장합니다.

방법과 결과략

mCVTs의 프로덕션 및 피쳐 분석

지질체 생산과 마찬가지로 지질 박막법은 mCVTs를 생산하는 데 사용됩니다.DOTAP 박막은 CG와 수화되어 CG를 감싸는 대형 다분자 지질체를 형성한다.이 부유액은 CG에서 나온 장막에서 DOTAP 지질을 함유하고 있습니다 (그림 3A 참조).우리 팀이 이전에 세운 방법에 따라 압출 후 이렇게 생성된 mCVTs가 지질과 CG막의 융합으로 구성되었음을 증명한다.일반적으로 mCVT의 크기 분포는 지질체와 비슷하다.다양한 세포계에서 이러한 방법의 안정성과 범용성을 입증하기 위해 일부 HTT 세포 (즉, 3T3-L1) 및 비암 세포 (즉, HEK293 및 RAW264.7) 와 같은 다양한 세포계의 CG를 사용하여 mCVTs를 만들었습니다.그림 3B에서 볼 수 있듯이 각종 mCVTs의 유체역학적 크기와 PDI는 보통 400나노미터 범위(PDI∼0.4)로 같은 압출 방법으로 생산되는 DOTAP 지질체(PDI∼0.2)와 유사하다.그림 3C에서 서로 다른 배합에서 유사한 zeta 전위 값 (약 +30 mV ~ +40 mV) 이 관찰되었으며, 이 방법은 서로 다른 세포계에서 생성 된 CG에 일반적으로 적용된다는 것을 보여줍니다. 흥미롭게도 mCVT3T3-L1이 pDNA와 재배합될 때 그 크기 분포는 재배합되지 않은 mCVTs와 비슷하고 전체 zeta 전위는 음수 있습니다. 이는 재배합이 성공적으로 이루어졌기 때문입니다 (CVs).

A. mCVTs의 안내도는 세포귀신과 수화박막으로 만든 지질체의 융합을 포함한다.

B. 서로 다른 mCVTs와 입자가 있는 mCVT3T3-L1의 수동 크기는 DOTAP 지질체와 비교된다.모든 mCVTs의 크기는 500nm 미만입니다.

C. DOTAP 지질체에 비해 다른 mCVTs와 입자가 있는 mCVT3T3-L1의 Zeta 전위.모든 mCVTs의 Zeta 전위는 +30 mV 이상이며, 입자 DNA (5 µg) 가 있는 mCVT3T3-L1을 제외하면 입자 DNA와의 상호 작용으로 인해 음의 Zeta 전위를 나타냅니다.데이터는 평균 ± SD(n = 3)를 나타냅니다.